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PermalinkArquivos Brasileiros de Endocrinologia & Metabologia
Print version ISSN 0004-2730
Arq Bras Endocrinol Metab vol.52 no.1 São Paulo Feb. 2008
http://dx.doi.org/10.1590/S0004-27302008000100004
REVISÃO
Síndrome de Kallmann: uma revisão histórica, clínica e molecular
Kallmann syndrome: a hystorical, clinical and molecular review
Rogério Silicani Ribeiro; Julio Abucham
Unidade de Neuroendocrinologia, Disciplina de Endocrinologia, Departamento de Medicina, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, SP, Brasil
Endereço para correspondência
RESUMO
A síndrome de Kallmann (SK) é a associação de hipogonadismo hipogonadotrófico (HH) e anosmia descrita por Maestre de San Juan, em 1856, e caracterizada como condição hereditária por Franz Josef Kallmann, em 1944. Muitos aspectos de sua patogenia, variabilidade fenotípica e genotípica foram desvendados nos últimos 15 anos. Conseqüentemente, tem sido difícil manter-se atualizado frente à rapidez que o conhecimento dessa condição é gerado. Nesta revisão, resgatamos aspectos históricos pouco conhecidos sobre a síndrome e seus descobridores; incorporamos novas descobertas relacionadas à embriogênese dos neurônios olfatórios e produtores de GnRH. Esse processo é fundamental para compreender a associação de hipogonadismo e anosmia; descrevemos a heterogeneidade fenotípica e genotípica, incluindo mutações em cinco genes (KAL-1, FGFR1, PROKR2, PROK2 e NELF). Para cada gene, discutimos a função da proteína codificada na migração e maturação dos neurônios olfatórios e GnRH a partir de estudos in vitro e modelos experimentais e descrevemos características clínicas dos portadores dessas mutações.
Descritores: Hipogonadismo hipogonadotrófico; Kallmann; KAL-1; FGFR1; PROKR2; PROK2
ABSTRACT
Kallmann syndrome (KS), the association of hypogonadotropic hypogonadism and anosmia, was described by Maestre de San Juan in 1856 and characterized as a hereditary condition by Franz Josef Kallmann in 1944. Many aspects such as pathogeny, phenotype and genotype in KS were described in the last fifteen years. The knowledge of this condition has grown fast, making it difficult to update. Here we review historical aspects of this condition and its discoverers and describe new findings regarding the embryogenesis of the olfactory bulb and GnRH secreting neuronal tracts that are important for understanding the association of hypogonadism and anosmia. Additionally, we describe the phenotypic and genotypic heterogeneity of KS, including five related genes (KAL-1, FGFR1, PROKR2, PROK2 e NELF), and discuss the function of each codified protein in migration and maturation of the olfactory and GnRH neurons, with data from in vitro and in vivo studies. Finally we describe the clinical phenotype of patients carrying these mutations.
Keywords: Hipogonadismo hipogonadotrófico; Kallmann; KAL-1; FGFR1; PROKR2; PROK2
HISTÓRICO
A PRIMEIRA DESCRIÇÃO DA ASSOCIAÇÃO de hipogonadismo e anosmia foi feita, em 1856, pelo médico e professor catedrático de anatomia da Faculdade de Medicina de Granada, Aureliano Maestre de San Juan (1828 - 1890), após a autópsia de um homem de 40 anos, apresentava bulbos olfatórios ausentes e "atrofia congênita" dos testículos e pênis (1). A possibilidade de um distúrbio olfatório foi, então, retrospectivamente investigada "con el objeto de utilizar para la ciencia este notabilísimo caso, traté a toda costa de averiguar algo acerca de las facultades olfatorias de este sujeto, y afortunadamente supe por una hermana del mismo, que su hermano Antonio nunca había tenido conciencia de los cuerpos olorosos, y así que era notable el cómo podía permanecer en cualquier paraje, aunque el olor en aquel punto fuera intolerable" ("com o objetivo de utilizar para a ciência este notável caso, tratei de averiguar algo sobre as faculdades olfatórias desse sujeito e, afortunadamente, soube por sua irmã que seu irmão Antônio nunca havia percebido odores, e assim era notável como podia ficar em qualquer lugar mesmo que o odor local fosse intolerável").
Aureliano Maestre de San Juan (Figura 1) foi o primeiro de uma geração de histologistas espanhóis, dentre os quais se destacou Ramon y Cajal, pai da teoria da plasticidade neuronal. Segundo as memórias escritas por Cajal, "... o boníssimo don Aureliano, a quem tanto nós discípulos venerávamos, sucumbiu depois de um acidente de laboratório..." (com soda cáustica), o que o deixou cego, tendo morrido pobre e esquecido. A descrição inédita da associação de hipogonadismo e anosmia, publicada por Maestre de San Juan na revista espanhola "El Siglo Médico", permaneceu pouco lembrada pela literatura médica (1).
Em 1944, cerca de 80 anos depois da descrição original de Maestre de San Juan, o geneticista alemão Franz Joseph Kallmann (1897 – 1965), um estudioso do caráter hereditário da esquizofrenia e do retardo mental, descreveu três famílias com 12 indivíduos hipogonádicos, dos quais nove eram portadores de anosmia, e dois eram retardados mentais. Kallmann demonstrou o caráter genético da doença, a maior prevalência em homens bem como sua variedade fenotípica (2).
Kallmann defendia a esterilização dos esquizofrênicos como forma de melhorar a raça humana e aprimorar a sociedade. Sua teoria foi usada pelos nazistas como "embasamento científico" para perseguição e extermínio de mais de 200 mil portadores de esquizofrenia e de outras formas de retardo mental, a maioria crianças, em campos de concentração, posteriormente utilizados para o extermínio de judeus e de outras minorias raciais. Ironicamente, Kallmann, filho de mãe judaica, viu-se forçado a migrar para os Estados Unidos para não acabar nos mesmos campos de extermínio criados sob inspiração de sua própria teoria (3). A despeito disso, sua contribuição originou e consagrou o epônimo "síndrome de Kallmann" na literatura médica do pós-guerra para descrever a associação de hipogonadismo e anosmia.
Mais recentemente, em 1954, De Morsier cunhou o termo displasia olfato-genital para descrever a coexistência de hipogonadismo e anosmia em 14 indivíduos, porém, ainda hoje, a utilização do epônimo síndrome de Kallmann para descrever essa associação prevalece na literatura (4).
FISIOPATOLOGIA DA ASSOCIAÇÃO DE HIPOGONADISMO E ANOSMIA NA SK
A fisiopatologia do hipogonadismo na SK começou a ser compreendida após o desenvolvimento das dosagens de gonadotrofinas por radioimunoensaio. Bardin e cols., em 1969, demonstraram que portadores de SK apresentavam baixos níveis de gonadotrofinas e ausência de resposta ao clomifeno, um agonista estrogênico parcial que aumenta a secreção de gonadotrofinas (5). Posteriormente, Naftolin e cols. demonstraram que a infusão endovenosa do hormônio liberador das gonadotrofinas (GnRH) restaurava a secreção de gonadotrofinas em portadores de SK, caracterizando a integridade funcional dos gonadotrofos e a deficiência hipotalâmica de secreção do GnRH (6).
A anosmia está relacionada à deficiência de GnRH porque a migração e diferenciação dos neurônios secretores de GnRH dependem da formação do bulbo olfatório (Figura 2). Tanto os neurônios do bulbo olfatório quanto os neurônios secretores de GnRH se originam no epitélio nasal embrionário e migram em direção às meninges, cruzando a placa cribiforme. Logo após, os corpos dos neurônios GnRH dirigem-se para a área pré-óptica do hipotálamo, guiando-se pelas projeções hipotalâmicas dos neurônios do bulbo as quais constituem o trato olfatório (7,8). Assim, defeitos na formação do bulbo e trato olfatórios desorientam a migração e a diferenciação dos neurônios GnRH.
EPIDEMIOLOGIA E QUADRO CLÍNICO
A prevalência da SK é estimada entre 1:10.000 e 1:80.000 nos homens (9) e cerca de 1:50.000 nas mulheres (10,11). A maioria dos casos é esporádica, mas a síndrome também pode ter caráter familiar. Os homens são mais freqüentemente acometidos do que as mulheres, em uma proporção aproximada de 4:1 nos casos esporádicos e de 2:1 nos casos familiares (12).
A SK é essencialmente caracterizada pela associação de hipogonadismo e anosmia. O hipogonadismo pode ser diagnosticado logo na infância em virtude da criptorquidia e/ou micropênis ou, mais comumente, na idade puberal em virtude da falta de desenvolvimento dos caracteres sexuais secundários (12). Mais raramente, alguns pacientes apresentarão reversão do hipogonadismo anos após o diagnóstico e início da reposição androgênica. Essa variante fenotípica tem sido denominada SK reversível e caracteriza-se por aumento do volume testicular, normalização dos níveis de testosterona e fertilidade após a suspensão da reposição androgênica (13-21).
O olfato dos portadores da SK pode estar totalmente ausente (anosmia) ou simplesmente reduzido (hiposmia). Os diferentes graus de comprometimento da função olfatória podem ser avaliados por meio da capacidade de reconhecer o odor de uma única substância apresentada em diferentes concentrações, como o álcool, ou da capacidade de discriminar o cheiro de substâncias distintas apresentadas em cápsulas ou cartões que exalam odor após serem abertos ou raspados como no teste de identificação de cheiros da Universidade de Pensilvânia ("UPSIT test") (22,23). Esses testes geram escores que permitem a quantificação objetiva da função olfatória. Além do comprometimento funcional, os portadores de SK freqüentemente apresentam defeitos morfológicos, como hipotrofia ou ausência do bulbo olfatório uni ou bilateral. A anatomia do bulbo olfatório pode ser mais bem avaliada por ressonância nuclear magnética de encéfalo, em T1, por intermédio de cortes coronais finos a partir da parede posterior do seio frontal até o quiasma óptico (24).
Os portadores de SK também podem apresentar outras malformações, como fenda palatina, palato ogival, agenesia renal unilateral ou bilateral (esta incompatível com a vida), sincinesia bimanual (movimentos em espelho), perda auditiva neurossensorial, daltonismo, pé cavo, déficit de aprendizagem, retardo mental, agenesia dental e defeitos da movimentação ocular (24,25).
O fenótipo reprodutivo, olfatório e as manifestações associadas podem ser diferentes em indivíduos pertencentes à mesma família, variando até mesmo entre gêmeos idênticos (26). Parentes de pacientes com SK clássica podem apresentar hipogonadismo isolado, anosmia isolada ou apenas retardo puberal, que apresenta prevalência 12 vezes maior do que na população geral (12,24,25,27).
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DO HIPOGONADISMO NA SK
O diagnóstico laboratorial do HH baseia-se na demonstração de níveis baixos de esteróides sexuais (testosterona no homem e estradiol na mulher) associados a níveis normais ou baixos de gonadotrofinas. A dosagem de testosterona total estabelece o diagnóstico na maioria dos casos, porém, quando os valores da testosterona total são limítrofes, pode ser necessário calcular a concentração de testosterona livre por intermédio das dosagens de testosterona total e de SHBG por radio-imunoensaio, a qual reflete melhor a fração biologicamente ativa da testosterona (28). Em mulheres, a dosagem do estradiol sérico pode ser normal ou baixa, por isso a amenorréia é um dado mais confiável que essa dosagem no diagnóstico do HH.
A ausência ou redução da resposta das gonadotrofinas ao teste agudo com GnRH confirma o diagnóstico de HH. A pulsatilidade das gonadotrofinas, avaliada por meio de dosagens seriadas, está geralmente ausente ou reduzida na SK, porém alguns indivíduos podem apresentar pulsatilidade normal e resposta das gonadotrofinas ao GnRH também normal (21,29).
GENÉTICA
A SK familiar apresenta vários padrões de herança, incluindo autossômico dominante, o mais comum, autossômico recessivo e ligado ao X, o que indica o envolvimento de diversos genes (25). Vinte por cento dos casos familiares apresentam mutações em um destes dois genes: KAL-1 (SK ligada ao X) e FGFR1 (SK autossômica dominante) (24,30). Estudos recentes identificaram três novos genes envolvidos na SK – NELF, PROKR2 e PROK2 – e demonstraram que um paciente pode apresentar mutações em mais de um desses cinco genes (31-33).
GENE KAL-1
A localização do gene KAL-1 em Xp22.3, responsável pela SK ligada ao X, foi determinada por meio de estudos citogenéticos em pacientes com síndrome de genes contíguos os quais também apresentavam hipogonadismo e anosmia associados a grandes deleções na porção distal do braço curto do cromossomo X a partir da posição Xp22.3, uma região que, na mulher, escapa à inativação (34). Em um feto de 19 semanas com uma deleção cromossômica a partir do Xp22.3, observou-se a ausência de neurônios GnRH no hipotálamo e acúmulo na meninge, em contraste com fetos normais, indicando um defeito migratório (35).
O gene KAL-1 (NCBI GeneID: 3730) foi clonado simultaneamente por dois grupos independentes (36,37). O KAL-1 possui 14 exons e codifica a anosmina-1, uma glicoproteína associada à matriz extracelular, que é expressa durante o desenvolvimento embrionário no bulbo olfatório, cerebelo, medula, rim e retina. A anosmina-1 apresenta uma região rica em cisteína, seguida por um domínio WAP (whey acidic protein-like four disulfide core), encontrado em diversos inibidores de serina-proteases, e quatro domínios FnIII (tandem fibronectin type III), homólogos aos de moléculas de adesão de células neurais com alta afinidade pelo heparan sulfato (HS) (38,39).
Estudos em cultura organotípica de neurônios olfatórios e secretores de GnRH demonstraram que a anosmina-1 tem ação quimiotáxica e direciona o crescimento dos axônios (alongamento axonal) desses neurônios. Além disso, a anosmina-1 estimula a ramificação e o desenvolvimento de neuritos axonais, o que contribui para o aumento da área de influência neuronal (38,39).
Até o momento, não foram identificados genes homólogos ao KAL-1 em ratos e camundongos, o que tem dificultado a realização de estudos in vivo para avaliar a função da anosmina-1. Em nematódeos Caenorhabiditis elegans transgênicos, a hiperexpressão do gene CeKal, homólogo ao KAL-1, induz mudanças no direcionamento do crescimento axonal e na ramificação neuronal, além de defeitos morfológicos da cabeça e cauda. A expressão de formas truncadas, sem o domínio WAP, altera o direcionamento axonal do neurônio, enquanto a expressão da forma sem os domínios FnIII altera tanto o direcionamento axonal quanto o padrão de ramificação axonal (40,41).
Recentemente, a expressão de fluoresceína nos neurônios GnRH de peixes transgênicos Medaka, transparentes durante a embriogênese, permitiu visualizar a origem olfatória dos neurônios GnRH, sua migração até à área pré-óptica ventral e o estabelecimento de conexões com a hipófise anterior. O silenciamento da expressão do gene homólogo ao KAL-1 com RNA "antisense" nesses peixes transgênicos impediu a migração e causou acúmulo dos neurônios GnRH no compartimento nasal, além de induzir defeitos na cavidade oral. Esse é o primeiro modelo experimental de SK induzido em um animal vertebrado e certamente permitirá um avanço no entendimento da SK (42).
O rastreamento de mutações no KAL-1 em portadores de SK revelou grande heterogeneidade dos defeitos moleculares, incluindo mutações missense e nonsense, mutações de junções de splicing, deleções intragênicas e deleções cromossomais submicroscópicas, localizadas ao longo de praticamente todos os exons do KAL-1. Algumas famílias com SK ligada ao X não apresentam mutações exônicas, o que pode indicar envolvimento de regiões intrônicas desse gene ou a existência de outros genes implicados nessa forma de SK (24,43,44).
O fenótipo da SK nos portadores de mutações do KAL-1 nem sempre se correlaciona com o genótipo e pode variar mesmo entre gêmeos monozigóticos que compartilham a mesma mutação (27). A maioria dos portadores de mutações do KAL-1 possui comprometimento severo da secreção de gonadotrofinas e quadro clínico evidente já ao nascimento, com criptorquidia em até 75% dos casos (12). No entanto, dois estudos diferentes descreveram indivíduos com mutação do KAL-1 e função gonadal normal (24,45). Recentemente, descrevemos o primeiro caso de SK reversível associado à mutação do KAL-1 (46).
Em mulheres portadoras de mutações do KAL-1, o fenótipo é menos severo que nos homens (12). Isso tem sido explicado pela localização do gene KAL-1 na região pseudo-autossômica do cromossomo X, a qual escapa da inativação desse cromossomo. Como as mulheres possuem duas cópias do X, a mutação em um dos alelos é compensada pelo outro alelo normal (47).
Além da variabilidade do fenótipo reprodutivo, um amplo espectro de defeitos olfatórios, anatômicos e funcionais tem sido encontrado em portadores de mutações no gene KAL-1, incluindo hipoplasia e agenesia do bulbo olfatório, uni ou bilateral, hiposmia em graus variados e anosmia. Alguns portadores de mutação do KAL-1 podem apresentar bulbos olfatórios e olfato normais (24).
Das outras manifestações associadas à SK, a sincinesia está presente em 75%, e a agenesia renal unilateral, em 30% dos portadores de SK ligada ao X, mas também podem ser encontradas, com menor prevalência, em outras formas da SK (48). Outras manifestações que podem ocorrer na SK por mutação do KAL-1 são surdez neurossensorial, palato em ogiva, pé cavo e anormalidades do movimento ocular (25).
GENE FGFR1
Assim como na SK ligada ao X, a localização de um dos genes responsáveis pela forma autossômica dominante da SK também baseou-se em estudos de portadores de síndrome de genes contíguos. Utilizando análise de segregação de marcadores polimórficos combinados com estudos de hibridização in situ, Dodé e cols. identificaram mutações na região 8p11.2-p12, que abrangia o gene FGFR1 (NCBI GeneID: 2260), em dois indivíduos apresentando SK associada à esferocitose (30).
Por intermédio do seqüenciamento de todos os exons do gene FGFR1 em 129 portadores de SK, foram encontradas mutações em heterozigose em quatro casos familiares e oito casos esporádicos, além de um indivíduo filho de pais consanguíneos apresentar mutação em homozigose. Nos indivíduos homozigóticos, a severidade da SK é maior que em indivíduos heterozigóticos. Esses achados permitiram associar as mutações do FGFR1 a uma forma autossômica dominante da SK (30). As diversas mutações identificadas na SK acarretam perda de função do FGFR1 (19,33,49-52). Em contraste, uma mutação ativadora do FGFR1 foi descrita em portadores de uma forma de craniossinostose conhecida como síndrome de Pfeiffer (53).
O gene FGFR1 é composto de 18 exons, sendo expresso em múltiplos tecidos embrionários, incluindo esqueleto, ouvido interno e porção rostral do encéfalo (17). O gene FGFR1 codifica o receptor tipo 1 do fator de crescimento do fibroblasto (FGFR1), um membro da superfamília dos receptores tirosina quinase. A estrutura do FGFR1 consiste de três domínios semelhantes a imunoglobulinas, um domínio acídico, um domínio transmembrana e dois domínios tirosina quinase (54).
O FGFR1 é ativado por alguns fatores de crescimento do fibroblasto (FGF). A ligação desses FGFs ao segundo e terceiro domínios semelhante a imunoglobulinas permite a dimerização do receptor e autofosforilação de resíduos tirosina no domínio intracelular (55). Nos neuroblastos GnRH provenientes do epitélio nasal embrionário humano, o FGF2 liga-se ao FGFR1 desencadeando a ativação de vias MAPK (mitogen-activated protein kinase). A presença de glicosaminoglicanos heparan-sulfato (HS) é fundamental para a formação do complexo FGFR1-FGF2 e ativação das vias intracelulares (56).
A anosmina-1, proteína codificada pelo KAL-1, interage com o complexo FGFR1-FGF2 como um co-ligante modulador que aumenta a quantidade de HS ligado ao complexo e amplifica a resposta das vias intracelulares (Figura 3). A formação do complexo "anosmina-1-FGFR1-FGF2-HS" permite a reorganização do citoesqueleto e o crescimento dos neuritos dos neuroblastos GnRH (56). O envolvimento do FGFR1 e da anosmina-1 em mecanismos comuns da migração e do desenvolvimento axonal dos neurônios GnRH explica a semelhança do fenótipo olfatório e reprodutivo da SK associada a mutações dos genes FGFR1 e KAL-1 (57).
A importância do FGFR1 na formação do bulbo olfatório pode ser demonstrada em camundongos transgênicos com mutação do FGFR1 restrita ao telencéfalo. Animais homozigóticos, mas não os heterozigóticos, apresentam aplasia do bulbo olfatório reproduzindo o fenótipo da SK em humanos. Esses animais morrem precocemente após o nascimento, pois a anosmia prejudica a sucção do leite materno (58).
Estudos de rastreamento genético nos portadores de SK identificaram mutações do gene FGFR1 em cerca de 6% a 8% dos casos esporádicos e até em 20% dos casos familiares. Assim como nas mutações do KAL-1, mutações do FGFR1 exibem grande heterogeneidade genotípica, fenótipo familiar variável e (33,49-52) maior severidade do fenótipo reprodutivo em relação aos pacientes com SK sem mutações nesses genes. Assim, uma alta prevalência de criptorquidia e micropênis tem sido observada em homens com mutações do FGFR1 (60% e 30%, respectivamente). Por outro lado, fenótipos reprodutivos mais leves, como retardo puberal ou anosmia isolada, são mais comuns em famílias com mutação no FGFR1 que no KAL-1 (19). Em famílias com a mesma mutação do FGFR1, o comprometimento da função gonadal é menos intenso nas mulheres do que nos homens, favorecendo a transmissão materna gene. Isso provavelmente se explica pela existência de duas cópias do gene KAL-1 nas mulheres, o que propiciaria maior concentração de anosmina-1 nas heterozigotas para o FGFR1, enquanto que os homens, que possuem apenas uma cópia do KAL-1, não disporiam desse mecanismo para compensar a haploinsuficiência do FGFR1 (57).
Embora não seja possível estabelecer uma correlação precisa entre fenótipo e genótipo na SK, pacientes com mutações do FGFR1 freqüentemente apresentam defeitos do palato e agenesia dental não descritos em portadores de mutação no KAL-1. Por outro lado, alguns pacientes com mutação no FGFR1 apresentam sincinesia bimanual, característica antes tida como exclusiva da SK ligada ao X (30,52).
GENES PROK2 E PROKR2
A identificação do envolvimento da procineticina (PROK) e seu receptor (PROKR) na SK ocorreu após a demonstração camundongos knock out para o gene da procineticina do tipo 2 (Prok2) apresentarem atrofia do bulbo olfatório e acúmulo de precursores de neurônios GnRH na região rostral da via migratória (38). Em seguida, observaram-se agenesia de bulbo olfatório, atrofia dos órgãos reprodutivos e ausência de neurônios secretores de GnRH no hipotálamo em camundongos com knock out do Prokr2, mas não do Prokr1 (30). Finalmente, mutações nos genes PROK2 e PROKR2 foram encontradas em portadores de SK (32).
O PROK2 (NCBI GeneID: 60675), um gene autossômico, localiza-se na posição 3p13, possui 13.403 pares de bases, contendo quatro exons (32), e codifica a procineticina tipo 2 (PROK2), uma proteína de 81 aminoácidos caracterizada pela presença de dez cisteínas conservadas formando cinco pontes disulfídicas e uma seqüência aminoterminal de seis aminoácidos altamente conservada (59). O PROKR2 (NCBI GeneID: 128674) localiza-se na posição 20p13, possui 1.155 pares de bases, contendo dois exons, e codifica o receptor tipo 2 da procineticina.
A PROK2 pode se ligar a dois subtipos de receptores transmembrana acoplados à proteína G, PROKR tipos 1 e 2, porém a afinidade da PROK2 para o PROKR2 é maior que a do PROK1. Em humanos, o PROKR 2 distribui-se em glândulas endócrinas – hipófise, testículos, ovário, adrenal e tiróide – e no sistema nervoso central. Além disso, os PROKR 1 e 2 são expressos no trato gastrintestinal (60).
Os receptores PROKR são acoplados a diferentes subtipos de proteína G, incluindo Gq, Gqi e Gs, o que permite ativação de diferentes vias de transdução intracelulares, inclusive a ativação de vias MAPK (60). As PROKs influenciam diversos eventos fisiológicos, como contração intestinal, hiperalgesia, espermatogênese, sobrevivência neuronal, ritmo circadiano, sono, angiogênese, comportamento alimentar e hematopoiese.
Em 192 portadores de SK (144 homens e 48 mulheres), incluindo 38 casos familiares, foram identificadas dez diferentes mutações (9 missense e 1 frameshift) no gene PROKR2 em dez casos esporádicos e em quatro famílias. Essas mutações localizavam-se nas porções intra e extracelular do receptor, bem como nos domínios da transmembrana. Ocorreram em heterozigose (dez casos), homozigose (dois casos) e heterozigose composta (dois casos), sendo que um paciente apresentou uma mutação no PROKR2 e outra no KAL-1. Curiosamente, o seqüenciamento de 500 alelos de indivíduos-controle identificou três mutações no PROKR2 (em heterozigose), duas idênticas às encontradas em pacientes com SK (em heterozigose ou em homozigose), além de uma nova mutação não observada na SK.
Nessa mesma população, o seqüenciamento do gene PROK2 identificou quatro diferentes mutações, duas em casos esporádicos e duas em famílias, sendo duas mutações missense, uma frameshift e uma causando uma troca de aminoácidos na seqüência de iniciação de tradução. Nenhuma mutação do gene PROK2 foi identificada no grupo controle (32).
É interessante notar que, além do fenótipo clássico da SK (hipogonadismo associado à anosmia), alguns portadores de mutação nos genes PROKR2 e PROK2 apresentaram hipogonadismo isolado ou anosmia isolada, e nenhum dos portadores de mutação apresentou outras manifestações comuns na SK, como sincinesia bimanual, alterações renais, agenesia dental e defeitos de face ou palato. Um dos portadores de mutação no gene PROK2 apresentava obesidade e alteração do sono, ambos severos. A importância da PROKR2 na regulação do ritmo circadiano e no comportamento alimentar já foi demonstrada em animais experimentais (32).
OUTROS GENES E DEFEITOS DIGÊNICOS NA SK
A identificação do gene NELF (NCBI GeneID 26012) e o reconhecimento de seu envolvimento no HH ocorreram a partir da análise comparativa da expressão de RNA mensageiro em neurônios GnRH ainda em migração com aqueles que já haviam completado sua migração durante a embriogênese do bulbo olfatório de camundongos. A expressão desse gene ocorria apenas durante a migração neuronal, cessando ao final do processo migratório. No camundongo, o NELF é expresso na superfície celular de neurônios olfatórios no epitélio nasal, sulco olfatório e telencéfalo, demarcando o caminho migratório dos neurônios GnRH durante o período embrionário. A interferência da expressão do gene NELF com RNA "antisense" em cultura de explantes nasais de camundongos reduz o crescimento dos axônios olfatórios e impede a migração dos neurônios GnRH (61). Em humanos, o gene NELF localiza-se na posição 9q34.3, possui 1.590 pares de bases contendo 16 exons e codifica uma proteína de 530 aminoácidos, com mais de 90% de homologia em relação aos camundongos.
Uma mutação no gene NELF (missense, sítio de splicing), em heterozigose, foi encontrada em apenas um de 32 pacientes com HH sem anosmia, mas nenhuma mutação foi observada em 33 pacientes com SK, dos quais 21 eram familiares (34). Em um estudo brasileiro recente, nenhuma mutação desse gene foi identificada em 17 pacientes com HH, incluindo 12 com SK (60).
Uma mutação do gene NELF e uma outra no FGFR1 foram identificadas em uma mesma família, cuja mãe era heterozigota para o NELF e apresentava clinodactilia e síndrome de Duane (síndrome da retração ocular), e o pai, heterozigoto para o gene FGFR1, referia retardo puberal e anosmia. Na prole, apenas o filho, que herdou ambas as mutações, apresentava SK (além de clinodactilia e defeitos de linha média); um outro filho, heterozigoto para a mutação do NELF, era eugonádico e apresentava clinodactilia; um terceiro, heterozigoto para FGFR1, também eugonádico, apenas apresentava defeitos de linha média (33,62). Em uma outra família, o pai era heterozigoto para duas mutações em genes distintos, uma no GnRHR (gene do receptor do GnRH, R262Q) e a outra no FGFR1 (R470L), tendo tido apenas retardo puberal, e a mãe era heterozigota simples para uma outra mutação no GnRHR (Q106R), sem nenhum fenótipo relacionado. Dos três filhos, duas eram heretozigotas compostas para as mutações do GnRHR e heterozigotas simples para a mutação do FGFR1, e ambas apresentavam HH sem anosmia. Essas famílias ilustram uma interessante possibilidade, a de que defeitos em mais de um gene (oligogênicos) relacionados à formação do sistema GnRH possam determinar a variação fenotípica encontrada em uma mesma família e antes denominada de "penetrância variável" de um defeito supostamente monogênico (31). Assim, nas formas oligogênicas, vários outros genes relacionados ao HH isolado sem anosmia (GnRH, GnRHR, DAX1, GPR54, LEPR) poderiam contribuir na expressão fenotípica de pacientes com SK, desde que mutações em genes envolvidos no desenvolvimento do sistema olfatório também estivessem presentes.
Síndrome de Kallmann: uma revisão histórica, clínica e molecular
Kallmann syndrome: a hystorical, clinical and molecular review
Rogério Silicani Ribeiro; Julio Abucham
Unidade de Neuroendocrinologia, Disciplina de Endocrinologia, Departamento de Medicina, Escola Paulista de Medicina, Universidade Federal de São Paulo, SP, Brasil
Endereço para correspondência
RESUMO
A síndrome de Kallmann (SK) é a associação de hipogonadismo hipogonadotrófico (HH) e anosmia descrita por Maestre de San Juan, em 1856, e caracterizada como condição hereditária por Franz Josef Kallmann, em 1944. Muitos aspectos de sua patogenia, variabilidade fenotípica e genotípica foram desvendados nos últimos 15 anos. Conseqüentemente, tem sido difícil manter-se atualizado frente à rapidez que o conhecimento dessa condição é gerado. Nesta revisão, resgatamos aspectos históricos pouco conhecidos sobre a síndrome e seus descobridores; incorporamos novas descobertas relacionadas à embriogênese dos neurônios olfatórios e produtores de GnRH. Esse processo é fundamental para compreender a associação de hipogonadismo e anosmia; descrevemos a heterogeneidade fenotípica e genotípica, incluindo mutações em cinco genes (KAL-1, FGFR1, PROKR2, PROK2 e NELF). Para cada gene, discutimos a função da proteína codificada na migração e maturação dos neurônios olfatórios e GnRH a partir de estudos in vitro e modelos experimentais e descrevemos características clínicas dos portadores dessas mutações.
Descritores: Hipogonadismo hipogonadotrófico; Kallmann; KAL-1; FGFR1; PROKR2; PROK2
ABSTRACT
Kallmann syndrome (KS), the association of hypogonadotropic hypogonadism and anosmia, was described by Maestre de San Juan in 1856 and characterized as a hereditary condition by Franz Josef Kallmann in 1944. Many aspects such as pathogeny, phenotype and genotype in KS were described in the last fifteen years. The knowledge of this condition has grown fast, making it difficult to update. Here we review historical aspects of this condition and its discoverers and describe new findings regarding the embryogenesis of the olfactory bulb and GnRH secreting neuronal tracts that are important for understanding the association of hypogonadism and anosmia. Additionally, we describe the phenotypic and genotypic heterogeneity of KS, including five related genes (KAL-1, FGFR1, PROKR2, PROK2 e NELF), and discuss the function of each codified protein in migration and maturation of the olfactory and GnRH neurons, with data from in vitro and in vivo studies. Finally we describe the clinical phenotype of patients carrying these mutations.
Keywords: Hipogonadismo hipogonadotrófico; Kallmann; KAL-1; FGFR1; PROKR2; PROK2
HISTÓRICO
A PRIMEIRA DESCRIÇÃO DA ASSOCIAÇÃO de hipogonadismo e anosmia foi feita, em 1856, pelo médico e professor catedrático de anatomia da Faculdade de Medicina de Granada, Aureliano Maestre de San Juan (1828 - 1890), após a autópsia de um homem de 40 anos, apresentava bulbos olfatórios ausentes e "atrofia congênita" dos testículos e pênis (1). A possibilidade de um distúrbio olfatório foi, então, retrospectivamente investigada "con el objeto de utilizar para la ciencia este notabilísimo caso, traté a toda costa de averiguar algo acerca de las facultades olfatorias de este sujeto, y afortunadamente supe por una hermana del mismo, que su hermano Antonio nunca había tenido conciencia de los cuerpos olorosos, y así que era notable el cómo podía permanecer en cualquier paraje, aunque el olor en aquel punto fuera intolerable" ("com o objetivo de utilizar para a ciência este notável caso, tratei de averiguar algo sobre as faculdades olfatórias desse sujeito e, afortunadamente, soube por sua irmã que seu irmão Antônio nunca havia percebido odores, e assim era notável como podia ficar em qualquer lugar mesmo que o odor local fosse intolerável").
Aureliano Maestre de San Juan (Figura 1) foi o primeiro de uma geração de histologistas espanhóis, dentre os quais se destacou Ramon y Cajal, pai da teoria da plasticidade neuronal. Segundo as memórias escritas por Cajal, "... o boníssimo don Aureliano, a quem tanto nós discípulos venerávamos, sucumbiu depois de um acidente de laboratório..." (com soda cáustica), o que o deixou cego, tendo morrido pobre e esquecido. A descrição inédita da associação de hipogonadismo e anosmia, publicada por Maestre de San Juan na revista espanhola "El Siglo Médico", permaneceu pouco lembrada pela literatura médica (1).
Em 1944, cerca de 80 anos depois da descrição original de Maestre de San Juan, o geneticista alemão Franz Joseph Kallmann (1897 – 1965), um estudioso do caráter hereditário da esquizofrenia e do retardo mental, descreveu três famílias com 12 indivíduos hipogonádicos, dos quais nove eram portadores de anosmia, e dois eram retardados mentais. Kallmann demonstrou o caráter genético da doença, a maior prevalência em homens bem como sua variedade fenotípica (2).
Kallmann defendia a esterilização dos esquizofrênicos como forma de melhorar a raça humana e aprimorar a sociedade. Sua teoria foi usada pelos nazistas como "embasamento científico" para perseguição e extermínio de mais de 200 mil portadores de esquizofrenia e de outras formas de retardo mental, a maioria crianças, em campos de concentração, posteriormente utilizados para o extermínio de judeus e de outras minorias raciais. Ironicamente, Kallmann, filho de mãe judaica, viu-se forçado a migrar para os Estados Unidos para não acabar nos mesmos campos de extermínio criados sob inspiração de sua própria teoria (3). A despeito disso, sua contribuição originou e consagrou o epônimo "síndrome de Kallmann" na literatura médica do pós-guerra para descrever a associação de hipogonadismo e anosmia.
Mais recentemente, em 1954, De Morsier cunhou o termo displasia olfato-genital para descrever a coexistência de hipogonadismo e anosmia em 14 indivíduos, porém, ainda hoje, a utilização do epônimo síndrome de Kallmann para descrever essa associação prevalece na literatura (4).
FISIOPATOLOGIA DA ASSOCIAÇÃO DE HIPOGONADISMO E ANOSMIA NA SK
A fisiopatologia do hipogonadismo na SK começou a ser compreendida após o desenvolvimento das dosagens de gonadotrofinas por radioimunoensaio. Bardin e cols., em 1969, demonstraram que portadores de SK apresentavam baixos níveis de gonadotrofinas e ausência de resposta ao clomifeno, um agonista estrogênico parcial que aumenta a secreção de gonadotrofinas (5). Posteriormente, Naftolin e cols. demonstraram que a infusão endovenosa do hormônio liberador das gonadotrofinas (GnRH) restaurava a secreção de gonadotrofinas em portadores de SK, caracterizando a integridade funcional dos gonadotrofos e a deficiência hipotalâmica de secreção do GnRH (6).
A anosmia está relacionada à deficiência de GnRH porque a migração e diferenciação dos neurônios secretores de GnRH dependem da formação do bulbo olfatório (Figura 2). Tanto os neurônios do bulbo olfatório quanto os neurônios secretores de GnRH se originam no epitélio nasal embrionário e migram em direção às meninges, cruzando a placa cribiforme. Logo após, os corpos dos neurônios GnRH dirigem-se para a área pré-óptica do hipotálamo, guiando-se pelas projeções hipotalâmicas dos neurônios do bulbo as quais constituem o trato olfatório (7,8). Assim, defeitos na formação do bulbo e trato olfatórios desorientam a migração e a diferenciação dos neurônios GnRH.
EPIDEMIOLOGIA E QUADRO CLÍNICO
A prevalência da SK é estimada entre 1:10.000 e 1:80.000 nos homens (9) e cerca de 1:50.000 nas mulheres (10,11). A maioria dos casos é esporádica, mas a síndrome também pode ter caráter familiar. Os homens são mais freqüentemente acometidos do que as mulheres, em uma proporção aproximada de 4:1 nos casos esporádicos e de 2:1 nos casos familiares (12).
A SK é essencialmente caracterizada pela associação de hipogonadismo e anosmia. O hipogonadismo pode ser diagnosticado logo na infância em virtude da criptorquidia e/ou micropênis ou, mais comumente, na idade puberal em virtude da falta de desenvolvimento dos caracteres sexuais secundários (12). Mais raramente, alguns pacientes apresentarão reversão do hipogonadismo anos após o diagnóstico e início da reposição androgênica. Essa variante fenotípica tem sido denominada SK reversível e caracteriza-se por aumento do volume testicular, normalização dos níveis de testosterona e fertilidade após a suspensão da reposição androgênica (13-21).
O olfato dos portadores da SK pode estar totalmente ausente (anosmia) ou simplesmente reduzido (hiposmia). Os diferentes graus de comprometimento da função olfatória podem ser avaliados por meio da capacidade de reconhecer o odor de uma única substância apresentada em diferentes concentrações, como o álcool, ou da capacidade de discriminar o cheiro de substâncias distintas apresentadas em cápsulas ou cartões que exalam odor após serem abertos ou raspados como no teste de identificação de cheiros da Universidade de Pensilvânia ("UPSIT test") (22,23). Esses testes geram escores que permitem a quantificação objetiva da função olfatória. Além do comprometimento funcional, os portadores de SK freqüentemente apresentam defeitos morfológicos, como hipotrofia ou ausência do bulbo olfatório uni ou bilateral. A anatomia do bulbo olfatório pode ser mais bem avaliada por ressonância nuclear magnética de encéfalo, em T1, por intermédio de cortes coronais finos a partir da parede posterior do seio frontal até o quiasma óptico (24).
Os portadores de SK também podem apresentar outras malformações, como fenda palatina, palato ogival, agenesia renal unilateral ou bilateral (esta incompatível com a vida), sincinesia bimanual (movimentos em espelho), perda auditiva neurossensorial, daltonismo, pé cavo, déficit de aprendizagem, retardo mental, agenesia dental e defeitos da movimentação ocular (24,25).
O fenótipo reprodutivo, olfatório e as manifestações associadas podem ser diferentes em indivíduos pertencentes à mesma família, variando até mesmo entre gêmeos idênticos (26). Parentes de pacientes com SK clássica podem apresentar hipogonadismo isolado, anosmia isolada ou apenas retardo puberal, que apresenta prevalência 12 vezes maior do que na população geral (12,24,25,27).
DIAGNÓSTICO LABORATORIAL DO HIPOGONADISMO NA SK
O diagnóstico laboratorial do HH baseia-se na demonstração de níveis baixos de esteróides sexuais (testosterona no homem e estradiol na mulher) associados a níveis normais ou baixos de gonadotrofinas. A dosagem de testosterona total estabelece o diagnóstico na maioria dos casos, porém, quando os valores da testosterona total são limítrofes, pode ser necessário calcular a concentração de testosterona livre por intermédio das dosagens de testosterona total e de SHBG por radio-imunoensaio, a qual reflete melhor a fração biologicamente ativa da testosterona (28). Em mulheres, a dosagem do estradiol sérico pode ser normal ou baixa, por isso a amenorréia é um dado mais confiável que essa dosagem no diagnóstico do HH.
A ausência ou redução da resposta das gonadotrofinas ao teste agudo com GnRH confirma o diagnóstico de HH. A pulsatilidade das gonadotrofinas, avaliada por meio de dosagens seriadas, está geralmente ausente ou reduzida na SK, porém alguns indivíduos podem apresentar pulsatilidade normal e resposta das gonadotrofinas ao GnRH também normal (21,29).
GENÉTICA
A SK familiar apresenta vários padrões de herança, incluindo autossômico dominante, o mais comum, autossômico recessivo e ligado ao X, o que indica o envolvimento de diversos genes (25). Vinte por cento dos casos familiares apresentam mutações em um destes dois genes: KAL-1 (SK ligada ao X) e FGFR1 (SK autossômica dominante) (24,30). Estudos recentes identificaram três novos genes envolvidos na SK – NELF, PROKR2 e PROK2 – e demonstraram que um paciente pode apresentar mutações em mais de um desses cinco genes (31-33).
GENE KAL-1
A localização do gene KAL-1 em Xp22.3, responsável pela SK ligada ao X, foi determinada por meio de estudos citogenéticos em pacientes com síndrome de genes contíguos os quais também apresentavam hipogonadismo e anosmia associados a grandes deleções na porção distal do braço curto do cromossomo X a partir da posição Xp22.3, uma região que, na mulher, escapa à inativação (34). Em um feto de 19 semanas com uma deleção cromossômica a partir do Xp22.3, observou-se a ausência de neurônios GnRH no hipotálamo e acúmulo na meninge, em contraste com fetos normais, indicando um defeito migratório (35).
O gene KAL-1 (NCBI GeneID: 3730) foi clonado simultaneamente por dois grupos independentes (36,37). O KAL-1 possui 14 exons e codifica a anosmina-1, uma glicoproteína associada à matriz extracelular, que é expressa durante o desenvolvimento embrionário no bulbo olfatório, cerebelo, medula, rim e retina. A anosmina-1 apresenta uma região rica em cisteína, seguida por um domínio WAP (whey acidic protein-like four disulfide core), encontrado em diversos inibidores de serina-proteases, e quatro domínios FnIII (tandem fibronectin type III), homólogos aos de moléculas de adesão de células neurais com alta afinidade pelo heparan sulfato (HS) (38,39).
Estudos em cultura organotípica de neurônios olfatórios e secretores de GnRH demonstraram que a anosmina-1 tem ação quimiotáxica e direciona o crescimento dos axônios (alongamento axonal) desses neurônios. Além disso, a anosmina-1 estimula a ramificação e o desenvolvimento de neuritos axonais, o que contribui para o aumento da área de influência neuronal (38,39).
Até o momento, não foram identificados genes homólogos ao KAL-1 em ratos e camundongos, o que tem dificultado a realização de estudos in vivo para avaliar a função da anosmina-1. Em nematódeos Caenorhabiditis elegans transgênicos, a hiperexpressão do gene CeKal, homólogo ao KAL-1, induz mudanças no direcionamento do crescimento axonal e na ramificação neuronal, além de defeitos morfológicos da cabeça e cauda. A expressão de formas truncadas, sem o domínio WAP, altera o direcionamento axonal do neurônio, enquanto a expressão da forma sem os domínios FnIII altera tanto o direcionamento axonal quanto o padrão de ramificação axonal (40,41).
Recentemente, a expressão de fluoresceína nos neurônios GnRH de peixes transgênicos Medaka, transparentes durante a embriogênese, permitiu visualizar a origem olfatória dos neurônios GnRH, sua migração até à área pré-óptica ventral e o estabelecimento de conexões com a hipófise anterior. O silenciamento da expressão do gene homólogo ao KAL-1 com RNA "antisense" nesses peixes transgênicos impediu a migração e causou acúmulo dos neurônios GnRH no compartimento nasal, além de induzir defeitos na cavidade oral. Esse é o primeiro modelo experimental de SK induzido em um animal vertebrado e certamente permitirá um avanço no entendimento da SK (42).
O rastreamento de mutações no KAL-1 em portadores de SK revelou grande heterogeneidade dos defeitos moleculares, incluindo mutações missense e nonsense, mutações de junções de splicing, deleções intragênicas e deleções cromossomais submicroscópicas, localizadas ao longo de praticamente todos os exons do KAL-1. Algumas famílias com SK ligada ao X não apresentam mutações exônicas, o que pode indicar envolvimento de regiões intrônicas desse gene ou a existência de outros genes implicados nessa forma de SK (24,43,44).
O fenótipo da SK nos portadores de mutações do KAL-1 nem sempre se correlaciona com o genótipo e pode variar mesmo entre gêmeos monozigóticos que compartilham a mesma mutação (27). A maioria dos portadores de mutações do KAL-1 possui comprometimento severo da secreção de gonadotrofinas e quadro clínico evidente já ao nascimento, com criptorquidia em até 75% dos casos (12). No entanto, dois estudos diferentes descreveram indivíduos com mutação do KAL-1 e função gonadal normal (24,45). Recentemente, descrevemos o primeiro caso de SK reversível associado à mutação do KAL-1 (46).
Em mulheres portadoras de mutações do KAL-1, o fenótipo é menos severo que nos homens (12). Isso tem sido explicado pela localização do gene KAL-1 na região pseudo-autossômica do cromossomo X, a qual escapa da inativação desse cromossomo. Como as mulheres possuem duas cópias do X, a mutação em um dos alelos é compensada pelo outro alelo normal (47).
Além da variabilidade do fenótipo reprodutivo, um amplo espectro de defeitos olfatórios, anatômicos e funcionais tem sido encontrado em portadores de mutações no gene KAL-1, incluindo hipoplasia e agenesia do bulbo olfatório, uni ou bilateral, hiposmia em graus variados e anosmia. Alguns portadores de mutação do KAL-1 podem apresentar bulbos olfatórios e olfato normais (24).
Das outras manifestações associadas à SK, a sincinesia está presente em 75%, e a agenesia renal unilateral, em 30% dos portadores de SK ligada ao X, mas também podem ser encontradas, com menor prevalência, em outras formas da SK (48). Outras manifestações que podem ocorrer na SK por mutação do KAL-1 são surdez neurossensorial, palato em ogiva, pé cavo e anormalidades do movimento ocular (25).
GENE FGFR1
Assim como na SK ligada ao X, a localização de um dos genes responsáveis pela forma autossômica dominante da SK também baseou-se em estudos de portadores de síndrome de genes contíguos. Utilizando análise de segregação de marcadores polimórficos combinados com estudos de hibridização in situ, Dodé e cols. identificaram mutações na região 8p11.2-p12, que abrangia o gene FGFR1 (NCBI GeneID: 2260), em dois indivíduos apresentando SK associada à esferocitose (30).
Por intermédio do seqüenciamento de todos os exons do gene FGFR1 em 129 portadores de SK, foram encontradas mutações em heterozigose em quatro casos familiares e oito casos esporádicos, além de um indivíduo filho de pais consanguíneos apresentar mutação em homozigose. Nos indivíduos homozigóticos, a severidade da SK é maior que em indivíduos heterozigóticos. Esses achados permitiram associar as mutações do FGFR1 a uma forma autossômica dominante da SK (30). As diversas mutações identificadas na SK acarretam perda de função do FGFR1 (19,33,49-52). Em contraste, uma mutação ativadora do FGFR1 foi descrita em portadores de uma forma de craniossinostose conhecida como síndrome de Pfeiffer (53).
O gene FGFR1 é composto de 18 exons, sendo expresso em múltiplos tecidos embrionários, incluindo esqueleto, ouvido interno e porção rostral do encéfalo (17). O gene FGFR1 codifica o receptor tipo 1 do fator de crescimento do fibroblasto (FGFR1), um membro da superfamília dos receptores tirosina quinase. A estrutura do FGFR1 consiste de três domínios semelhantes a imunoglobulinas, um domínio acídico, um domínio transmembrana e dois domínios tirosina quinase (54).
O FGFR1 é ativado por alguns fatores de crescimento do fibroblasto (FGF). A ligação desses FGFs ao segundo e terceiro domínios semelhante a imunoglobulinas permite a dimerização do receptor e autofosforilação de resíduos tirosina no domínio intracelular (55). Nos neuroblastos GnRH provenientes do epitélio nasal embrionário humano, o FGF2 liga-se ao FGFR1 desencadeando a ativação de vias MAPK (mitogen-activated protein kinase). A presença de glicosaminoglicanos heparan-sulfato (HS) é fundamental para a formação do complexo FGFR1-FGF2 e ativação das vias intracelulares (56).
A anosmina-1, proteína codificada pelo KAL-1, interage com o complexo FGFR1-FGF2 como um co-ligante modulador que aumenta a quantidade de HS ligado ao complexo e amplifica a resposta das vias intracelulares (Figura 3). A formação do complexo "anosmina-1-FGFR1-FGF2-HS" permite a reorganização do citoesqueleto e o crescimento dos neuritos dos neuroblastos GnRH (56). O envolvimento do FGFR1 e da anosmina-1 em mecanismos comuns da migração e do desenvolvimento axonal dos neurônios GnRH explica a semelhança do fenótipo olfatório e reprodutivo da SK associada a mutações dos genes FGFR1 e KAL-1 (57).
A importância do FGFR1 na formação do bulbo olfatório pode ser demonstrada em camundongos transgênicos com mutação do FGFR1 restrita ao telencéfalo. Animais homozigóticos, mas não os heterozigóticos, apresentam aplasia do bulbo olfatório reproduzindo o fenótipo da SK em humanos. Esses animais morrem precocemente após o nascimento, pois a anosmia prejudica a sucção do leite materno (58).
Estudos de rastreamento genético nos portadores de SK identificaram mutações do gene FGFR1 em cerca de 6% a 8% dos casos esporádicos e até em 20% dos casos familiares. Assim como nas mutações do KAL-1, mutações do FGFR1 exibem grande heterogeneidade genotípica, fenótipo familiar variável e (33,49-52) maior severidade do fenótipo reprodutivo em relação aos pacientes com SK sem mutações nesses genes. Assim, uma alta prevalência de criptorquidia e micropênis tem sido observada em homens com mutações do FGFR1 (60% e 30%, respectivamente). Por outro lado, fenótipos reprodutivos mais leves, como retardo puberal ou anosmia isolada, são mais comuns em famílias com mutação no FGFR1 que no KAL-1 (19). Em famílias com a mesma mutação do FGFR1, o comprometimento da função gonadal é menos intenso nas mulheres do que nos homens, favorecendo a transmissão materna gene. Isso provavelmente se explica pela existência de duas cópias do gene KAL-1 nas mulheres, o que propiciaria maior concentração de anosmina-1 nas heterozigotas para o FGFR1, enquanto que os homens, que possuem apenas uma cópia do KAL-1, não disporiam desse mecanismo para compensar a haploinsuficiência do FGFR1 (57).
Embora não seja possível estabelecer uma correlação precisa entre fenótipo e genótipo na SK, pacientes com mutações do FGFR1 freqüentemente apresentam defeitos do palato e agenesia dental não descritos em portadores de mutação no KAL-1. Por outro lado, alguns pacientes com mutação no FGFR1 apresentam sincinesia bimanual, característica antes tida como exclusiva da SK ligada ao X (30,52).
GENES PROK2 E PROKR2
A identificação do envolvimento da procineticina (PROK) e seu receptor (PROKR) na SK ocorreu após a demonstração camundongos knock out para o gene da procineticina do tipo 2 (Prok2) apresentarem atrofia do bulbo olfatório e acúmulo de precursores de neurônios GnRH na região rostral da via migratória (38). Em seguida, observaram-se agenesia de bulbo olfatório, atrofia dos órgãos reprodutivos e ausência de neurônios secretores de GnRH no hipotálamo em camundongos com knock out do Prokr2, mas não do Prokr1 (30). Finalmente, mutações nos genes PROK2 e PROKR2 foram encontradas em portadores de SK (32).
O PROK2 (NCBI GeneID: 60675), um gene autossômico, localiza-se na posição 3p13, possui 13.403 pares de bases, contendo quatro exons (32), e codifica a procineticina tipo 2 (PROK2), uma proteína de 81 aminoácidos caracterizada pela presença de dez cisteínas conservadas formando cinco pontes disulfídicas e uma seqüência aminoterminal de seis aminoácidos altamente conservada (59). O PROKR2 (NCBI GeneID: 128674) localiza-se na posição 20p13, possui 1.155 pares de bases, contendo dois exons, e codifica o receptor tipo 2 da procineticina.
A PROK2 pode se ligar a dois subtipos de receptores transmembrana acoplados à proteína G, PROKR tipos 1 e 2, porém a afinidade da PROK2 para o PROKR2 é maior que a do PROK1. Em humanos, o PROKR 2 distribui-se em glândulas endócrinas – hipófise, testículos, ovário, adrenal e tiróide – e no sistema nervoso central. Além disso, os PROKR 1 e 2 são expressos no trato gastrintestinal (60).
Os receptores PROKR são acoplados a diferentes subtipos de proteína G, incluindo Gq, Gqi e Gs, o que permite ativação de diferentes vias de transdução intracelulares, inclusive a ativação de vias MAPK (60). As PROKs influenciam diversos eventos fisiológicos, como contração intestinal, hiperalgesia, espermatogênese, sobrevivência neuronal, ritmo circadiano, sono, angiogênese, comportamento alimentar e hematopoiese.
Em 192 portadores de SK (144 homens e 48 mulheres), incluindo 38 casos familiares, foram identificadas dez diferentes mutações (9 missense e 1 frameshift) no gene PROKR2 em dez casos esporádicos e em quatro famílias. Essas mutações localizavam-se nas porções intra e extracelular do receptor, bem como nos domínios da transmembrana. Ocorreram em heterozigose (dez casos), homozigose (dois casos) e heterozigose composta (dois casos), sendo que um paciente apresentou uma mutação no PROKR2 e outra no KAL-1. Curiosamente, o seqüenciamento de 500 alelos de indivíduos-controle identificou três mutações no PROKR2 (em heterozigose), duas idênticas às encontradas em pacientes com SK (em heterozigose ou em homozigose), além de uma nova mutação não observada na SK.
Nessa mesma população, o seqüenciamento do gene PROK2 identificou quatro diferentes mutações, duas em casos esporádicos e duas em famílias, sendo duas mutações missense, uma frameshift e uma causando uma troca de aminoácidos na seqüência de iniciação de tradução. Nenhuma mutação do gene PROK2 foi identificada no grupo controle (32).
É interessante notar que, além do fenótipo clássico da SK (hipogonadismo associado à anosmia), alguns portadores de mutação nos genes PROKR2 e PROK2 apresentaram hipogonadismo isolado ou anosmia isolada, e nenhum dos portadores de mutação apresentou outras manifestações comuns na SK, como sincinesia bimanual, alterações renais, agenesia dental e defeitos de face ou palato. Um dos portadores de mutação no gene PROK2 apresentava obesidade e alteração do sono, ambos severos. A importância da PROKR2 na regulação do ritmo circadiano e no comportamento alimentar já foi demonstrada em animais experimentais (32).
OUTROS GENES E DEFEITOS DIGÊNICOS NA SK
A identificação do gene NELF (NCBI GeneID 26012) e o reconhecimento de seu envolvimento no HH ocorreram a partir da análise comparativa da expressão de RNA mensageiro em neurônios GnRH ainda em migração com aqueles que já haviam completado sua migração durante a embriogênese do bulbo olfatório de camundongos. A expressão desse gene ocorria apenas durante a migração neuronal, cessando ao final do processo migratório. No camundongo, o NELF é expresso na superfície celular de neurônios olfatórios no epitélio nasal, sulco olfatório e telencéfalo, demarcando o caminho migratório dos neurônios GnRH durante o período embrionário. A interferência da expressão do gene NELF com RNA "antisense" em cultura de explantes nasais de camundongos reduz o crescimento dos axônios olfatórios e impede a migração dos neurônios GnRH (61). Em humanos, o gene NELF localiza-se na posição 9q34.3, possui 1.590 pares de bases contendo 16 exons e codifica uma proteína de 530 aminoácidos, com mais de 90% de homologia em relação aos camundongos.
Uma mutação no gene NELF (missense, sítio de splicing), em heterozigose, foi encontrada em apenas um de 32 pacientes com HH sem anosmia, mas nenhuma mutação foi observada em 33 pacientes com SK, dos quais 21 eram familiares (34). Em um estudo brasileiro recente, nenhuma mutação desse gene foi identificada em 17 pacientes com HH, incluindo 12 com SK (60).
Uma mutação do gene NELF e uma outra no FGFR1 foram identificadas em uma mesma família, cuja mãe era heterozigota para o NELF e apresentava clinodactilia e síndrome de Duane (síndrome da retração ocular), e o pai, heterozigoto para o gene FGFR1, referia retardo puberal e anosmia. Na prole, apenas o filho, que herdou ambas as mutações, apresentava SK (além de clinodactilia e defeitos de linha média); um outro filho, heterozigoto para a mutação do NELF, era eugonádico e apresentava clinodactilia; um terceiro, heterozigoto para FGFR1, também eugonádico, apenas apresentava defeitos de linha média (33,62). Em uma outra família, o pai era heterozigoto para duas mutações em genes distintos, uma no GnRHR (gene do receptor do GnRH, R262Q) e a outra no FGFR1 (R470L), tendo tido apenas retardo puberal, e a mãe era heterozigota simples para uma outra mutação no GnRHR (Q106R), sem nenhum fenótipo relacionado. Dos três filhos, duas eram heretozigotas compostas para as mutações do GnRHR e heterozigotas simples para a mutação do FGFR1, e ambas apresentavam HH sem anosmia. Essas famílias ilustram uma interessante possibilidade, a de que defeitos em mais de um gene (oligogênicos) relacionados à formação do sistema GnRH possam determinar a variação fenotípica encontrada em uma mesma família e antes denominada de "penetrância variável" de um defeito supostamente monogênico (31). Assim, nas formas oligogênicas, vários outros genes relacionados ao HH isolado sem anosmia (GnRH, GnRHR, DAX1, GPR54, LEPR) poderiam contribuir na expressão fenotípica de pacientes com SK, desde que mutações em genes envolvidos no desenvolvimento do sistema olfatório também estivessem presentes.
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